3.2.1. エレクトロポレーションは機能ゲノミクスを促進する。

トランスフェクションにおけるin vitroエレクトロポレーションの主な利点は、一般的な方法論を非常に広範囲の細胞タイプとペイロードの組み合わせに適用できることです。例としては、初代ヒトT細胞（42 ）、間葉系幹細胞（43）、THP-1マクロファージ（44、45）、初代ヒト単球（46）、ヒト胚性幹細胞（47、48 ）、ヒト神経幹細胞（49）、造血幹細胞（50 ）などが挙げられます。エレクトロポレーションは、機能ゲノミクスへの関心の爆発的な高まりと相まって、技術的な復活を遂げています。エレクトロポレーションなどの非ウイルス性トランスフェクション法は、科学界に、遺伝子、細胞機能、およびタンパク質発現の機能的関係を調査するための比較的安価な研究ツールを提供します。エレクトロポレーションが適用可能な細胞タイプの数が多いため、基礎研究と応用研究の両方で貴重なツールとなっています。例えば、低分子干渉RNAの電気穿孔法による送達は、RNA干渉を介して遺伝子発現を選択的に制御するために使用でき（51）、ハイスループットゲノムスクリーニングを容易にすることができます（52 ）。これらの方法は、細菌感染における細胞死のメカニズムの解明（ 53）から腫瘍微小環境における免疫抑制（54 ）に至るまで、さまざまな用途に使用されています。相同組み換えは、遺伝子機能の関係を明らかにするためにも使用でき（55）、造血幹細胞においてrAAV6（組み換えアデノ随伴ウイルス血清型6）と組み合わせて電気穿孔法で送達されたCRISPR / Cas9リボ核タンパク質を使用して実装されています（50）。電気穿孔法は、多くの一次細胞型を含む、ウイルスの形質導入にあまり適していない細胞型で特に有用であることが証明されています。

3.2.2. 遺伝子工学および遺伝子編集のための電気穿孔法

最も刺激的な治療領域の一つは、治療のためにヒト細胞（自己または同種）を患者に投与する養子細胞療法である。この療法は、健康なドナーからの未改変細胞、または遺伝子操作された細胞を使用することができる。電気穿孔法は、これらの両方の状況で利用することができる。電気穿孔法は、末梢血単核細胞（PBMC）から抗原提示細胞を生成するために使用され、養子細胞療法のためのヒト中心記憶由来エフェクターCD8 ^{+ T細胞の生着を研究するために使用されている（} 56 ）。トランスフェクトされたPBMCを用いてT細胞を刺激したところ、ヒト化マウスモデルにおいて、中心記憶T細胞はエフェクター記憶T細胞と比較して生着が改善されたという知見が得られた。遺伝子治療の初期の取り組みではウイルスベクターが利用されたが、ベクター関連白血病を引き起こしたが、この課題は電気穿孔法を活用した非ウイルスベクターベースのアプローチによって軽減されている（57、58）。安定した遺伝子発現が必要な場合、遺伝子編集の初期研究では、Sleeping BeautyなどのトランスポゾンがDNA挿入のための有効な送達メカニズムとなることが明らかになっています（59 ）。最初の発見以来、トランスポゾンの開発は遺伝子編集用に最適化されてきました（27、60 ）。初期の研究では、抗腫瘍活性を持つ初代ヒトT細胞を改変する際に、Sleeping Beautyベースのプラスミド挿入がレンチウイルスベクターの代替として使用できることが示されました（61）。ウイルスベクターとは異なり、転座はゲノムの高活性領域に優先的ではなく、よりランダムであるため、ウイルスベクターと比較して遺伝毒性の可能性が低い可能性があります。潜在的な安全性の利点を考慮して、ミニサークルDNAベクターの形態のSleeping Beautyトランスポゾンは、CD19キメラ抗原受容体（CAR）T細胞を改変するためにも利用されています（62）。ミニサークル形式は、安定したゲノム統合を示しましたが、トランスポゾンで一般的に使用されていたプラスミドよりも毒性が低いことが示されました。これらの改変された CAR T 細胞は、in vitro および in vivo の両方で抗癌細胞活性を示しました。

トランスポゾンの研究は継続していますが、最近の取り組みは主に CRISPR コンストラクト、特に CRISPR/Cas9 の導入に重点が置かれています。ノックアウトとノックインの両方の用途で、さまざまな CRISPR ベースの技術がエレクトロポレーションとともに使用されています。エレクトロポレーションは、初代ヒト T 細胞への DNA 挿入のために CRISPR/Cas9 ゲノムターゲティングと組み合わせられています ( 42 )。この研究では、単一遺伝子性自己免疫疾患の患者の細胞における病原性変異の修正と、がん抗原を標的とする T 細胞における内因性 T 細胞受容体 (TCR) 遺伝子座位の改変 TCR への置換が実証されています。注目すべきことに、改変された TCR T 細胞は、in vitro でがん細胞を死滅させました。エレクトロポレーションは、初代ヒト T 細胞での機能研究を行うための SLICE (Cas9 タンパク質エレクトロポレーションによるシングルガイド RNA レンチウイルス感染) として知られるスクリーニング方法の一部としても使用されていますこれまで、レンチウイルスベクターを用いたCRISPRスクリーニングは、ウイルス導入効率が低いため困難でした。本研究では、レンチウイルスシングルガイドRNAの導入とCas9タンパク質のエレクトロポレーションを組み合わせ、ゲノム規模の機能喪失スクリーニングを実施しました。その結果、SLICE法によって、in vitroで抗癌活性を改善する標的を特定できることが明らかになりました。別の研究では、CRISPRプールスクリーニングプラットフォームを初代マウス制御性T細胞（Treg）と共に使用し、Treg機能のマスターレギュレーターであるFoxp3の制御に関連する遺伝子改変を特定しました（ 64 ）。この研究では、Tregベースの免疫療法の潜在的なターゲットとなる可能性のあるFoxp3の正と負のレギュレーターをいくつか特定しました。他の研究では、ウイルス導入とエレクトロポレーションを組み合わせて、in vitroアッセイを用いてCRISPRスクリーンを実施し、T細胞の枯渇につながる重要な因子を特定しました（65）。

電気穿孔法とCRISPRに基づく遺伝子編集の最も有望な応用の一つが臨床応用に至り、承認に向けて前進しています。本研究では、電気穿孔法とCRISPR/Cas9を組み合わせ、鎌状赤血球症およびβサラセミアの患者におけるBCL11A遺伝子を編集し、胎児ヘモグロビンの産生を誘導します（ 66）。初期の臨床結果は有望であり、本研究の患者にとって非常に良好な初期転帰が得られています。

3.3.1. マイクロ流体電気穿孔法

マイクロ流体電気穿孔装置は、少量のサンプルおよび試薬で迅速かつ高感度な分析を実現できるという独自の能力（67）により、バッチ式バルク電気穿孔法（すなわち、電気穿孔キュベット）と比較して、キュベットベースの技術に関連する問題に対処できる利点を提供する。第一に、マイクロ流体装置の小型電極は、細胞膜を一時的に破壊するのに十分な電界を確立するために、大幅に低い電圧を使用することを可能にする。小型電極と低電圧は、気泡発生やジュール熱などの悪影響を最小限に抑えながら、均一な電界を提供することができる。第二に、マイクロ流体装置に必要な表面積対体積比と少量のサンプルは、優れた放熱性をもたらす。第三に、透明材料（例：ポリジメチルシロキサン、ガラス、石英）の使用により、トランスフェクションプロセスのin situ観察とリアルタイムモニタリングを通じて、電気穿孔条件の探索と最適化が可能になる（68）。第四に、マイクロ流体アプローチは、マイクロチャネルの寸法と電極構成を変更するための設計柔軟性を提供する。電極やマイクロチャネルの位置と寸法を容易に調整して局所的に増強された電界を確立し、トランスフェクション効率を向上させたり、単一細胞の電気穿孔法を可能にしたりすることができる。最後に、マイクロ流体デバイスは、フロースルー方式で連続的に電気穿孔法を実行できるため、放熱を助け、全体的なスループットを向上させることができる。これらの機能により、従来の電気穿孔法に関連する特定の問題を克服し、トランスフェクション効率と細胞生存率を向上させることができるため、高いトランスフェクション率と生存率が求められる用途においてマイクロ流体アプローチが有望視されている。マイクロ流体ベースの電気穿孔法デバイスは、多くのレビュー記事（69、70）で幅広く議論されている。このレビューでは、連続的かつ単一細胞レベルでの電気穿孔を目的としたデバイスに焦点を当てる。

フロースルー電気穿孔法の概念は、2001年に、2つの平行な金板電極（図2a ）を備えたマイクロチップを用いた研究で初めて提案されました（ 71 ） 。このマイクロチップでは、2つの電極に挟まれた領域を流れる細胞が、さまざまな流速で連続的に電気穿孔されました。それ以来、効率、スループット、細胞生存率を改善するために、電極設計（図2b）またはマイクロチャネル（69、70 ）を変更することにより、マイクロ流体電気穿孔装置内の電界を局所的に強化する多くの試みが行われてきました。マイクロチャネル設計の変更は、電界強度を局所的に強化する最も一般的な方法であり、特定の幅（より広いチャネル）の主要なマイクロチャネルを、トランスフェクションを容易にするために局所的に狭くなったマイクロチャネルで設計します（72、73 ）（図2c）。狭いマイクロチャネルは単一細胞のサイズ（10～20 μm）に近くすることができるため、複数の細胞が通過でき、広いマイクロチャネルと狭いマイクロチャネルの幅の差は、局所的に増強された電界を生成するのに十分に大きい。例えば、Luらは、5つの狭窄領域が直列に接続されたマイクロ流体電気穿孔装置を報告しており、これにより、1つの連続したDC電圧源のみを適用しながら、細胞に5つの電気パルスを与えることができる。この装置を使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞にpEGFP-C1プラスミドDNAを導入したところ、低流量（< 2 mL/分）および高流量（最大約20 mL/分）では約75%の導入効率が得られましたが、高流量では導入効率が低下しました。

同様の概念は、可逆的および不可逆的な細菌電気穿孔法にも採用されている（68、74 ）。フロースルー型のマイクロ流体ベースの電気穿孔プラットフォームのスケーラビリティを改善するための他の取り組みも行われている。たとえば、Tandonと同僚（75）は、トランスフェクションする細胞を培養培地から電気穿孔緩衝液に移し、その後すぐに細胞を電気穿孔する、すべて連続的なフロースルー方式で可能な統合デバイスを作成した。この統合デバイスを使用して、彼らは、標準的な培養培地から電気穿孔緩衝液への初代ヒトT細胞の培地交換を、約86％の培地交換効率で実証し、続いて、最大約60％の効率でメッセンジャーRNAをコードする蛍光タンパク質をT細胞にトランスフェクトした。マイクロ流体電気穿孔プラットフォームの別の例として、液滴ベースの物理学を採用したもの（図2d ）があり、トランスフェクション用途に有望であることが示されている（76、77）。しかし、設計の複雑さと下流での相分離の必要性から、このようなデバイスは広く普及していません。実際には、ほとんどのマイクロ流体電気穿孔プラットフォームは、製造プロセスのコストが高いため大規模には導入されていませんが、特に遺伝子導入が難しい細胞種において、小規模な研究にはメリットをもたらす可能性があります。

最近、研究者らは、ソフトリソグラフィー、CNC（コンピュータ数値制御）加工、3Dプリンティングといった高度な製造プロセスを必要としない低コストのマイクロ流体電気穿孔装置（78）を開発しました。この装置の費用対効果を考慮すると、トランスフェクション領域と関連するバッファーを再設計することで、哺乳類細胞への応用も可能となるでしょう。

3.3.2. ナノ構造を介した電気穿孔法

ナノスケール工学の出現により、ナノ材料やナノ構造をマイクロ流体チャネルと統合して、単一細胞電気穿孔法の電界を局所的に強化することが可能になった。ナノ構造を介した電気穿孔法は、従来のキュベットやフロースルー型マイクロ流体デバイスとは異なり、細胞膜の破壊を最小限に抑えながら、ペイロードの送達を高度に制御し、より標的を絞った電気穿孔を行うことを目的としています。Boukany ら ( 79 ) は、2 つのマイクロチャネルが直径約 90 nm のナノチャネルで橋渡しされた、初期のナノチャネル支援電気穿孔法デバイスを報告しました。2 つのマイクロチャネルに電気パルスを印加すると、ナノチャネル領域内に局所的に増幅された電界が生成され、細胞とナノチャネルのサイズが異なるため、増幅された電界は細胞膜の比較的小さな領域に作用しました。この技術は、細胞膜の破壊を最小限に抑えながら、細胞質へのカーゴの送達を促進し、細胞生存率を向上させる可能性があります。パルスの数、持続時間、大きさなどの電気的パラメータを調整することで、制御された貨物の配送を実現しました。

スループットを改善するため、研究者らは、2D（80）または3D（81）ナノチャネル（またはナノポア）アレイを備えたデバイスを開発し、一度に複数の細胞を並行して電気穿孔できるようにしました。中空の針状ナノ構造のアレイをマイクロ流体チャネルと統合したナノストロー（図2g）は、ナノポアに基づく電気穿孔法の別の形式です（82、83 ）。電気パルスが適用されると、局所的に強化された電界がナノ構造全体に生成され、細胞膜の破壊を最小限に抑えてペイロードの送達につながります。最適化されたナノストロー支援電気穿孔デバイスは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、ヒト胚性幹細胞、線維芽細胞、マウス初代グリア細胞など、トランスフェクションが難しい多くの初代細胞タイプにトランスフェクションでき、トランスフェクション効率は60％から80％の範囲です。

単一細胞レベルでより標的を絞った、空間的に制御可能なペイロード送達を実現するために、研究者らは、原子間力顕微鏡（AFM）（84 – 86）と統合された、改良型ナノポア支援エレクトロポレーションプラットフォームを作製し、ナノファウンテンエレクトロポレーション（図 2h）と呼ばれています。AFM のプローブは、ペイロードの保管と輸送を目的とした中空マイクロチャネルに接続されたサブミクロンの開口部を持つように設計されました。プローブは、空間的に制御可能な方法で、標的細胞膜の任意の位置に簡単に接触させることができます。接触すると、電界が適用され、細胞膜が局所的に透過性になり、パルス強度に応じて 1 ～ 100 nm の範囲の孔が膜に開きます。この小さな孔と慎重に調整された流速を組み合わせることで、細胞へのダメージを最小限に抑えながら、ペイロードの正確な投与量が得られます（84、86）。

これらのナノ材料およびナノ構造を介した技術は高いトランスフェクション効率を達成できるものの、本質的にバッチ処理であるため、スループットと拡張性に限界があります。さらに、その多くは高価で高度かつ複雑な製造プロセスを必要とします。さらに、細胞をナノ構造表面に均一に分散させるために追加の装置が必要になる場合があり、ペイロードサイズは実装されたナノ構造のサイズによって制限されます。これらの問題を克服しなければ、これらのプラットフォームは広く普及しません。

4.1.1. 電気化学療法

電気穿孔法は、化学療法剤の腫瘍細胞への取り込みを促進するために、初めて生体内で臨床利用されました（93 ）。最も開発された電気穿孔法（ECT）薬剤はブレオマイシン（BLM）とシスプラチン（CDDP）です。電気穿孔法をBLMまたはCDDPと併用すると、細胞毒性がそれぞれ1,000倍と80倍に向上します（94-96）。

1987 年、Okino と Mohri ( 93 ) は電気パルスと化学療法剤を組み合わせた初めての研究者となった。彼らは、肝細胞癌 (HCC) に侵された Donryu ラットに BLM 投与後に 2 ms、5,000 V/cm のパルスを 1 回だけ与えた。この併用プロトコルにより、腫瘍サイズがコントロールよりも 17% 減少した。Mir ら ( 97 ) は後に、100 μs、1,500 V/cm の電気パルスを 8 回与えることでヌードマウスの腫瘍サイズが著しく減少し、腫瘍が完全に消滅したという実験から、このプロセスを電気化学療法 (ECT) と名付けた。ECT はそれ以来、局所的腫瘍アブレーション治療の主流となり、2023 年初頭の時点では、主に皮膚癌や皮膚転移を標的として使用されている。これまでのレビューは ECT の主な用途に焦点を当てていたため、次のサブセクションでは新たな用途に焦点を当てる。

4.1.2. 深部腫瘍に対する新たな電気化学療法研究

ECTの主な標的部位は小さな表在性腫瘍でしたが、近年、開腹手術におけるECTの有効性が実証されています。この治療法を深部悪性腫瘍の経皮的治療にも拡大する取り組みが進められています。

4.1.3. 電気遺伝子伝達

遺伝物質は電気穿孔法（エレクトロポレーション）の影響下で細胞に導入することができます。このプロセスは電気遺伝子導入（EGT）、遺伝子電気導入、またはDNA電気穿孔法と呼ばれ、プラスミドDNAを電気パルスに続いて標的組織に注入します。現在の遺伝子送達システムは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに基づいています。ウイルスベクターは導入効率が高いものの、再現性と細胞に導入できるDNAのサイズに限界があります。非ウイルスシステムはこれらの限界を克服できますが、導入効率には限界があります。導入効率は、負に帯電したDNAを逸らす負に帯電した細胞膜、密集した細胞骨格ネットワーク、そして核膜によって阻害されます。

電気穿孔法を介したDNAワクチン接種は、これらの限界を克服するのに役立ちます。電界下で測定された外因性物質の取り込み量は、電界がない場合の手法と比較して、桁違いに多くなります。この違いは、( a )電気穿孔法の最初のパルスが細胞を透過性にし、( b )パルスが細胞膜の一時的な孔を通るDNAの電気泳動を促進するという2段階のプロセスによるものだという説が広く信じられつつあります。

DNAを細胞に輸送することは、欠陥細胞の特性を変化させる有用な手段です。この技術は主に実験室でのトランスフェクションアッセイで用いられていますが、臨床現場での応用はまだ研究段階にあります。2023年初頭現在、25件の臨床試験が実施中または参加者を募集中です。対象には、ヒトパピローマウイルス関連がん、HIV陽性肛門病変、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、肺がん、B型肝炎およびC型肝炎感染症、デングウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）が含まれます。

4.3.1. 電気免疫療法

免疫療法は最近、様々な分野の研究者や臨床医の注目を集めています。電気穿孔法は細胞膜を開いて薬物分子を侵入させる一方で、細胞内タンパク質も細胞外へ脱出することができ、細胞外へ脱出して細胞外環境にさらされると、身体に脆弱性を知らせる損傷関連分子パターンとして機能します ( 130 )。電気穿孔法に基づく免疫応答誘導が熱ベースの技術より決定的に優れている点は、これらの抗原を変性させることなく放出できることです。この免疫原性応答の増強により、CD8 ⁺ T細胞応答が高まり、原発性腫瘍、未治療の遠隔腫瘍、および転移巣が根絶されます。ECTを受けた免疫不全マウスは免疫能のあるマウスよりも腫瘍の退縮が有意に少なく ( 131 )、免疫システムがECTの有効性に非常に重要であるという考えを裏付けています。 ECT後、B細胞、NK細胞、NK T細胞、マクロファージ、樹状細胞が腫瘍内空間に浸潤し（132）、Tregの数は減少します。

EGTの使用により、研究者らは高用量サイトカイン療法の副作用の限界を克服することができました。動態と発現レベルの制御により、EGTを介してプラスミドDNAの濃度を送達しながら、その有効性を維持し、治療薬の存在を延長することができます。さらに、研究ではECTとEGTの併用が検討されています。ECTは局所腫瘍を標的とし、EGTによるサイトカイン送達はECTの全身効果を高め、免疫系の活性化を介して非原発性病変を根絶し、新しい腫瘍の形成と転移を予防します（133、134）。電気穿孔法に基づく療法は非熱的であるため、機能的な血管を温存し、CD8 + T細胞浸潤をより促進できるため、熱または放射線に基づく療法^よりも電気穿孔法による免疫応答がより顕著になる可能性があります。熱損傷の可能性が低い場合でも、軽度から中等度の熱影響を軽減するための熱緩和技術を組み込むことで、免疫活性化を促進し、ひいては患者の転帰を改善することができます（122、135、136 ）。電気穿孔法に基づくあらゆる治療法が免疫刺激にプラスの影響を与えることが示されているため、異なる電気穿孔法関連治​​療法の組み合わせを検討するさらなる研究が進められるべきです。

4.3.2. 放射線増感剤としての電気穿孔法

放射線療法は多くの悪性腫瘍の標準治療となっている。しかし、悪性表現型と健常表現型を区別できないため、研究者らは悪性表現型の放射線感受性を高める方法を模索してきた。これらの方法には、BLMやCDDPなどの放射線増感剤が含まれる。ECTと放射線照射を併用すると、生体内研究において、BLMとCDDPの放射線増感作用はそれぞれ1.9倍と1.26倍に増加する（137、138 ）。さらに、電気穿孔法単独でも放射線感受性の増加につながることが観察されている。このプロセスが起こるメカニズムは完全には解明されていないが、細胞内水性液の増加、フリーラジカルによる損傷の増加、一本鎖切断修復の阻害、DNA修復の遅延のすべてがDNA修復の失敗を増強するという説明が考えられる（139 ）。ある研究では、照射の10分前に100μsのパルスを1回照射すると、放射線感受性が1.18倍に上昇することがわかっています。放射線感受性のウィンドウは最大50分間有意であったため、臨床現場では、患者が安全な量の電気穿孔法とそれに続く放射線照射を受けるための現実的な時間枠が確保されています（140）。さらに、電気穿孔法は放射線増強剤として使用でき、悪性細胞を殺すために必要な放射線量を減らすことができます。中等度リスク前立腺がん患者を対象とした単施設での実現可能性試験では、患者がIREとそれに続く磁気共鳴ガイド下放射線治療を受け、現在、患者を募集しています（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05345444を参照）。IREと放射線療法の併用は安全かつ実現可能であることが証明され、これらの患者に最適な治療を提供することが期待されています。

4.3.3. カルシウム電気穿孔法

CaEPは、電気穿孔法を用いて高濃度のカルシウムを細胞内に送達する新しい方法です。ミトコンドリア内のカルシウムは、細胞増殖、分化、細胞死といった細胞プロセスに関与する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能します（141、142 ）。カルシウムは外膜内では自由に移動できますが、内膜を通過するにはイオンチャネルとトランスポーターの助けが必要です。

ECTと同様に、CaEPは腫瘍内腔にカルシウムを注入し、その後電気穿孔法を用いてカルシウムを細胞外から細胞内へ移行させる治療法です。カルシウムの大量流入はミトコンドリア膜透過性遷移を引き起こします。この遷移によりミトコンドリア内膜の透過性が阻害され、破壊されたミトコンドリアからのATP産生が低下し、恒常性を回復するためにATP消費量が増加します。このイオン恒常性の喪失とATP枯渇は、壊死またはアポトーシスによる細胞死をもたらします。細胞死は、活性酸素種、リパーゼ、プロテアーゼの生成によっても引き起こされる可能性があります（143）。

CaEPは、EGT中に注入されたトランスジーンの発現を、有害事象発生時に停止させるために使用することができます（144）。2012年に、研究者らは初めてCaEPを抗癌剤として用いることを提案しました（145）。それ以来、臨床試験を含む多くの研究で、CaEPは皮膚腫瘍に対するECTと同等の効果があることが明らかになっています（146）。